RSS

Produksi N-Asetil-D-Glukosamin Secara Enzimatik dari Kitin Menggunakan Crude Enzim Aeromonas sp. PTCC1691

08 Jun

Abstrak

Penelitian ini diarahkan untuk produksi N-asetil-D-glukosamin (G1cNAc) dengan hidrolisis parsial koloid α-kitin menggunakan preparasi crude enzim dari Aeromonas sp. PTCC 1691. Produksi selektif G1cNAc diamati terus-menerus selama hidrolisis kitin dan pada periode waktu yang sama, produksi oligomer G1cNAc itu diabaikan (di bawah 0,5%). Produksi maksimum G1cNAc, yield 79%, diperoleh setelah inkubasi 24 jam pada rasio enzim-substrat 2 U mg1. Hasil ini menunjukkan bahwa kompleks enzim multi-chitinolytic yang diproduksi oleh Aeromonas sp. PTCC 1691 dapat digunakan untuk biokonversi limbah kitin dalam bentuk N-asetil-D-glukosamin untuk aplikasi industri.

Kata Kunci : Aeromonas sp. PTCC 1691, kitin, crude enzim, hidrolisis enzimatik, N-asetil-D-glukosamin

A.  Pendahuluan

Kitin merupakan biopolimer yang paling berlimpah kedua di alam setelah selulosa. Produk degradasi kitin berupa N-asetil-D-glukosamin (G1cNAc) mendapat perhatian karena aplikasinya di bidang kedokteran, pertanian, makanan, farmasi dan bioteknologi. Oligosakarida kitin diketahui memiliki aktivitas sebagai agen anti mikroba, anti jamur dan aktivitas anti tumor. Umumnya GlcNAc diproduksi oleh hidrolisis asam dari kitin, suatu proses yang dilakukan dalam asam pekat pada suhu tinggi. Prosedur ini memiliki beberapa masalah seperti biaya tinggi, hasil yang rendah dan limbah asamnya. Oleh karena itu banyak perhatian telah difokuskan pada hidrolisis enzimatik untuk produksi G1cNAc dari kitin. Kitinase adalah kelompok enzim kompleks yang mengkatalisis degradasi kitin. Enzim ini telah ditemukan di banyak organisme termasuk virus, bakteri, jamur, serangga, tanaman dan hewan. Penelitian ini menggambarkan produksi efektif N-asetil-D-glukosamin dari kitin dengan preparasi crude enzim dari isolat baru (Aeromonas sp. PTCC 1691).

B.  Pembahasan

1.    Tinjauan Pustaka

Kitin merupakan senyawa yang memiliki bentuk padat dan bersifat tidak larut dalam air atau pelarut organik biasa. Namun kitin dapat dimodifikasi secara kimiawi menjadi turunan-turunannya yang mempunyai sifat-sifat khas dan kegunaannya sendiri (Yurnaliza, 2002). Aeromonas sp merupakan bakteri heterotrophik unicellular, bakteri ini biasanya berukuran 0,7-1,8 x 1,0-1,5 µm dan bergerak menggunakan sebuah polar flagel. Bakteri ini berbentuk batang sampai dengan kokus dengan ujung membulat, fakultatif anaerob, dan bersifat mesofilik dengan suhu optimum 20 – 30 ºC.

2.    Bahan

Mikroorganisme dan budidaya kondisi: Strain bakteri diisolasi dari limbah cangkang udang. Sampel yang dikumpulkan dari bagian utara Iran menggunakan medium agar yang mengandung kitin koloid 0,5% sebagai media selektif. Strain ini lebih diidentifikasi sebagai Aeromonas sp. menggunakan sifat morfologi dan biokimia bersama dengan 16S rRNA analisis urutan parsial dan disimpan sebagai PTCC 1691 pada Persian Type Culture Collection (Tehran, Iran).

 3.    Metoda

a.      Preparasi Kitin Koloid

Koloid kitin dibuat menurut metode Roberts dan Selitrennikoff (1988) dengan beberapa modifikasi. 5 gram bubuk kitin dari cangkang kepiting ditambahkan perlahan-lahan ke dalam 90 ml HCl terkonsentrasi dengan pengadukan selama 2 jam. Campuran ditambahkan ke 500 ml es dingin EtOH (95%) dengan pengadukan dan didiamkan semalaman pada 25 °C dan kemudian disimpan pada -20 0C. Selanjutnya disentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 °C dan beberapa kali dicuci dengan penyangga sodium fosfat 0,1 M (pH 7,0) sampai pH alami. Kemudian kitin koloid dijaga pada kondisi 4 °C sampai digunakan.

b.      Kondisi biakan untuk produksi kitinase

Untuk produksi enzim Aeromonas sp. PTCC 1691 ditumbuhkan dalam medium cair yang mengandung (g L-1) kitin koloid 7,5; Na2HPO4 0,65; KH2PO4 1,5; NaC1 0,25; (NH4)2SO4 1,5; MgSO4 0,12; MgC12 1,52; CaC12 0,005 dan Triton X-100, 0,2% (v/v) dalam labu takar pada 30 °C, pH 8,0 dan 150 rpm. Setelah inkubasi selama 2 hari, kaldu kultur disentrifugasi pada suhu 4 °C selama 10 menit pada 8000 rpm dan supernatan dikumpulkan dan disimpan pada -20 °C untuk percobaan lebih lanjut.

c.       Aktivitas enzim

Aktivitas kitinase ditentukan dengan koloid kitin sebagai substrat. Larutan enzim (0,3 ml) ditambahkan pada 0,3 mL larutan yang mengandung substrat kitin koloid 1% dalam buffer natrium fosfat (0,1 M, pH 8,0). Campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama 45 menit. Pelepasan gula diukur oleh metode asam Dinitrosalicylic (DNS) (Miller, 1959) pada 540 nm menggunakan N-asetil-D-glukosamin (G1cNAc) sebagai standar. Untuk penentuan aktivitas β-N-acetylglucosaminidase, campuran reaksi yang mengandung 100 µL p-nitrophenyl-N- acetylglucosaminide (5 mM), 100 µL crude enzim dan 200 µL 0,1 M natrium buffer fosfat (pH 8,0). Setelah inkubasi pada 37 °C selama 1 jam, 1 mL NaOH-glisin (0,2 M, pH 10.5) ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Pelepasan jumlah p-nitrofenol ditentukan dengan mengukur absorbansi pada 405 nm.

d.      Hidrolisis enzim dari kitin

Sebuah reaksi enzimatik khas untuk produksi G1cNAc ditentukan dengan menginkubasi campuran konsentrasi crude enzim dan substrat kitin dalam 0,1 M buffer fosfat (pH 8,0) pada 37 °C dalam sodium azida (200 ppm) sebagai pengawet. Pada setiap titik sebagian dari campuran reaksi merupakan sampel, diencerkan dengan air dan kemudian dicampurkan dengan CH3CN di rasio 30:70 (v/v), disaring dan dianalisis dengan HPLC (kolom, Shodex Asahipak NH2P-50, fase gerak, asetonitril/air (70:30, v/v); laju alir , 1,0 mL menit-1; deteksi pada 210 nm).

 4.    Hasil dan Diskusi

a.      Seleksi bakteri kitin dan preparasi crude enzim

Dalam laporan sebelumnya (Jami Al Ahmadi et.al, 2008a, b) 5 strain kitin: JK1, JK2, JK3, JK4 dan JK5 dimurnikan dan diuji untuk aktivitas β-N-acetylglucosaminidase setelah pertumbuhan dalam media cair kitin. Di antara strain tersebut JK1 menunjukkan aktivitas kitinase relatif tinggi sehingga dipilih untuk studi lebih lanjut. Atas dasar studi morfologi, biokimia dan molekuler, JK1 diidentifikasi sebagai Aeromonas sp. dan disimpan di Persian Type Culture Collection (PTCC 1691). Aktivitas enzim supernatan kultur strain ini maksimal pada 2d setelah inokulasi (9,2 U mL-1) dan sesudah itu menurun (data tidak ditunjukkan). Oleh karena itu biakan supernatan dari 2d digunakan dalam preparasi crude enzim untuk hidrolisis dari koloid
kitin dan produksi  GlcNAc bubuk kitin dari cangkang kepiting digunakan sebagai substrat untuk pencernaan oleh bakteri crude kitinase karena kelimpahan yang lebih dan biaya yang relatif rendah dibandingkan dengan β-kitin.

b.      Hidrolisis enzimatik untuk produksi kitin G1cNAc

 Gambar 1. Aliran produksi G1cNAc dari kitin koloid oleh crude enzim yang diproduksi bakteri Aeromonas sp. PTCC 1691. Kitin: (S) = 20 mg mL-1; crude enzim 4 U; pH 8,0 (0,1 M buffer fosfat); 37 °C; 100 rpm

 Produksi G1cNAc meningkat pesat dengan peningkatan waktu inkubasi dalam 24 jam pertama, sedangkan 48 jam berikutnya tidak ada produksi yang terjadi. Dalam penelitian yang disajikan di sini, hasil maksimum produksi GlcNAc adalah 42% setelah 24 jam inkubasi. Penurunan tingkat hidrolisis setelah 24 jam mungkin disebabkan karena denaturasi enzim selama reaksi atau inhibisi produk G1cNAc. Hasil ini menyarankan bahwa penghambatan umpan balik dari produk akhir mungkin merupakan penyebab kecil dari penurunan dalam tingkat produksi. Selanjutnya bahwa struktur substrat α-kitin itu sendiri mungkin merupakan alasan utama untuk penurunan tingkat produksi G1cNAc.

 c.        Pengaruh konsentrasi substrat pada produksi G1cNAc

Gambar 2 menunjukkan pengaruh konsentrasi substrat pada produksi N-asetil-D-glukosamin. Ketika konsentrasi kitin koloid dinaikkan dari 5 sampai 10 mg mL-1, sekaligus menjaga konsentrasi enzim konstan, hasil persentase GlcNAc itu meningkat secara signifikan. Tetapi jika terjadi peningkatan konsentrasi substrat yang lebih tinggi maka menghasilkan persentase yield G1cNAc yang lebih rendah, sehingga dalam 100 mg mL-1 dari kitin koloid setelah 12 dan 24 jam inkubasi, GlcNAc diproduksi masing-masing dengan hasil dari 11 dan 21,5%.

  Gambar 2. Pengaruh konsentrasi dari αkitin pada produksi G1cNAc. crude enzim: 4 U; pH 8,0 (0,1 M buffer fosfat); 37 ° C; 100 rpm

 

 d.      Pengaruh konsentrasi enzim pada produksi G1cNAc

 Gambar 3. Pengaruh konsentrasi enzim pada produksi G1cNAc. Kitin: (S) = 10 mg mL-1; crude enzim: 4, 8,10 dan 20 U; pH 8,0 (0,1 M buffer fosfat); 37 ° C; 100 rpm

Seperti dapat dilihat pada Gambar 3, persentase hasil G1cNAc meningkat dengan peningkatan dalam jumlah enzim dan konsentrasi yang lebih tinggi dari enzim mengarah ke produksi lebih dari G1cNAc tersebut. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam produksi GlcNAc antara 10 mg/4 U dan 10 mg/8 U. Produksi maksimum G1cNAc diperoleh yield 79% setelah 24 jam inkubasi pada rasio enzim-substrat 2 U mg-1. Hasil dari GlcNAc meningkat pesat selama 24 jam tetapi setelah itu produksi G1cNAc hampir berhenti.

C.  Kesimpulan

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa preparasi crude enzim dari isolasi kitin Aeromonas sp. PTCC 1691 adalah efektif dalam produksi enzim N-asetil-D-glukosamin dari α-kitin dengan yield yang baik pada prosedur sederhana dan cukup ringan. Hasil ini menunjukkan strain ini sebagai sumber yang berharga untuk produksi enzim selektif G1cNAc dari kitin.

Dari Jurnal : K. Jamialahmadi, et.al. Asian Network for Scientific Information, Biotechnology 1 0 (3): 292-297 (2011)

Referensi Pendukung :

Akhir, et.al. (2009). Medium optimisation of chitinase enzyme production from shrimp waste using bacillus licheniformis th-1 by response surface methods. Asian Network for Scientific Information. Biotechnology 8 (1): 120-125.

Jami al ahmadi, et.al. (2008). Optimization of medium and cultivation conditions for chitinase production by the newly isolated: Aeromonas.sp. Asian Network for Scientific Information. Biotechnology 7 (2): 266-272.

Yurnaliza. (2002). Senyawa khitin dan kajian aktivitas enzim mikrobial pendegradasinya. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara: Medan.

Iche marina dewi. (2008). Isolasi bakteri dan uji aktivitas kitinase termofilik kasar dari sumber air panas tinggi raja simalungun. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara: Medan.

Renia Debi Lestari. (2011) Tugas Makalah Bioteknologi. SPs UPI Bandung.

 
Leave a comment

Posted by on June 8, 2012 in BIOTEKNOLOGI

 

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

 
%d bloggers like this: